讓活細胞裡的蛋白各自亮起來：AI設計NovoTags拓展多色顯微成像

在細胞裡辨認特定蛋白，難處不只在於把它照亮，還要讓多個標記彼此不混色、不干擾原有功能，並承受長時間成像。華盛頓大學、HHMI珍妮莉亞研究園區與歐洲分子生物學實驗室團隊如今以人工智慧從頭設計出一組小型螢光標籤NovoTags，試圖結合基因標記的精準定位與小分子染料的高亮度、耐光性。

研究人員分別為可穿透細胞的JF657、JF596與JF494染料設計結合蛋白，涵蓋遠紅、橙紅與綠色光譜。這三種NovoTags能以低奈莫耳等級的親和力選擇各自的染料；研究團隊再將標籤接到目標蛋白上，使不同細胞構造在加入染料後顯現，而不必依賴天然螢光蛋白本身發光。

設計並非只在電腦裡完成。團隊利用RFdiffusion建立蛋白骨架、以LigandMPNN安排胺基酸序列，再用AlphaFold與RoseTTAFold篩選候選物，之後透過酵母表面展示、流式細胞分選、定序及生化分析逐步驗證。NovoTag657與染料結合後的晶體結構亦以2.38埃解析度測定；這個135個胺基酸的單體構造與運算模型接近，為設計是否真正落實到原子尺度提供實驗支持。

在哺乳類細胞中，三種標籤可同時標示不同次細胞區室。研究人員也在人類細胞株展示活細胞STED超解析顯微鏡與螢光壽命成像：除了依顏色區分訊號，還能利用染料受周遭蛋白環境影響而產生的發光時間差異，增加同一視野可辨識的標記組合。研究團隊提出未來或可藉光譜與壽命的排列追蹤更多蛋白，但一次辨認多達30種標記仍是發展目標，並非本次研究已完成的實證。

這套系統另一項延伸是NovoSplit。研究人員把標籤拆成兩部分，分別接到不同蛋白；加入指定染料後，染料如同分子膠促使兩半組裝，同時產生螢光訊號。它因而既可回報兩個蛋白是否靠近，也可用化學方式啟動其互動。團隊另製作能與染料形成共價鍵的版本，以提高標記的持久性。

不過，NovoTags目前仍是研究工具，而非臨床成像技術。公開結果主要來自培養的人類或其他哺乳類細胞，尚未證明它在組織、完整動物或長時間追蹤中的表現；把人工蛋白接到研究對象上、再加入染料，也可能改變蛋白位置、互動或細胞狀態，需依實驗逐一排除。不同染料的細胞通透性、背景訊號與毒性，同樣會限制可用條件。

研究刊於《Science》，顯示生成式蛋白設計的角色正從預測結構走向製造可操作的細胞工具。若後續能建立更多彼此正交、體積更小且毒性更低的標籤，它們可能進一步銜接冷凍關聯光學與電子顯微鏡，讓研究者先在活細胞中找到目標，再追查其原位結構；現階段最實際的價值，則是為多色成像與蛋白互動實驗增加一套可程式化選項。