El error más difícil de detectar en la edición genética: UNCOVERseq incorpora los raros efectos fuera del objetivo al panorama de seguridad

A medida que la edición genética avanza hacia aplicaciones terapéuticas, el verdadero desafío no consiste únicamente en modificar la ubicación correcta, sino también en poder detectar errores presentes en cantidades extremadamente pequeñas que, aun así, podrían entrañar riesgos. Un equipo de investigación presentó UNCOVERseq en «Nature Communications», un método basado en células para buscar sitios de edición fuera del objetivo de CRISPR, con la intención de incorporar a la evaluación de riesgos las ediciones de baja frecuencia que antes podían pasar fácilmente inadvertidas antes de que las terapias candidatas entren en la fase preclínica.

UNCOVERseq es una versión mejorada de GUIDE-seq: primero permite que marcadores de ADN bicatenario se inserten en los cortes causados por Cas9 y después realiza amplificación mediante PCR dependiente de RNasa H y secuenciación. El equipo añadió oligonucleótidos bloqueadores para reducir los productos inútiles formados por los adaptadores y los marcadores, y ajustó los procesos de alineamiento de secuencias y filtrado estadístico, de modo que el número limitado de lecturas de secuenciación se concentrara más en las verdaderas uniones genómicas.

En una prueba de referencia entre métodos establecida con dos ARN guía, EMX1 y FANCF, los investigadores confirmaron mediante secuenciación ultraprofundizada los sitios de edición reales. UNCOVERseq obtuvo una sensibilidad analítica del 97,6% y una precisión del 78%; la primera cifra indica que se omitieron menos sitios reales fuera del objetivo, mientras que la segunda significa que alrededor de tres cuartas partes de los sitios clasificados como candidatos fueron validados posteriormente. El método no demuestra directamente que cada sitio candidato haya sido modificado, sino que genera primero una lista más fiable que puede someterse a confirmación mediante secuenciación dirigida.

Posteriormente, el estudio utilizó células HEK293-Cas9, en las que es fácil amplificar las señales fuera del objetivo, para cribar 192 ARN guía. Después seleccionó seis ARN guía, que abarcaban distintos grados de especificidad, y los probó en células madre y progenitoras hematopoyéticas procedentes de tres donantes. La comparación incluyó Cas9 convencional, Cas9 de alta fidelidad y editores de bases de adenina y citosina; los resultados de reproducibilidad y detección de baja frecuencia presentados previamente en un póster del equipo de investigación también coincidieron con la orientación general del artículo definitivo.

Un hallazgo importante desde el punto de vista práctico fue que la clasificación de los sitios fuera del objetivo revelada por los cortes de ADN bicatenario mostró una correlación con la frecuencia de los efectos fuera del objetivo causados por la edición de bases. Esto implica que los desarrolladores podrían utilizar primero métodos consolidados de detección basados en cortes para delimitar ubicaciones de alto riesgo y después confirmar la edición real mediante secuenciación dirigida, como rhAmpSeq. No obstante, esto es solo el punto de entrada para el cribado de riesgos y no puede sustituir la validación específica para cada editor, tipo celular y diferencia genética entre pacientes.

El estudio también puso de manifiesto el coste de «mirar más a fondo». Cuantos más sitios candidatos de baja frecuencia se detectan, mayor es el coste de la confirmación posterior; si se omiten las réplicas biológicas, podrían pasar inadvertidos más de una cuarta parte de los sitios candidatos del estudio que cumplían los criterios básicos de priorización. Más importante aún, la comparación principal de rendimiento del 97,6% y el 78% se estableció únicamente con dos ARN guía, y no los 192 ARN guía fueron sometidos a una validación entre métodos igualmente exhaustiva.

Además, la mayoría de los autores trabajan en Integrated DNA Technologies, empresa que proporciona reactivos y servicios relacionados, y el artículo señala expresamente que la prueba aún no ha sido validada de forma integral y que el producto es solo para uso en investigación. Por tanto, UNCOVERseq resulta más apropiado como marco cuantificable para proponer sitios candidatos, con la posibilidad de establecer controles del flujo de trabajo, que como una respuesta estándar capaz de determinar por sí sola la seguridad clínica; su verdadero valor dependerá de que laboratorios independientes puedan reproducir los resultados y de que pueda formar, junto con otros métodos complementarios, un conjunto coherente de evidencias para los reguladores.