Convertir las ribozimas en herramientas reutilizables: un nuevo sistema desentraña un paso clave para la producción en masa de ARN circular

El ARN circular carece de los dos extremos fácilmente atacados por las nucleasas, por lo que es más resistente a la degradación que el ARN lineal y también podría permitir una expresión de proteínas más duradera. Sin embargo, lograr que estas moléculas tengan suficiente pureza y estabilidad, con un coste controlable, sigue siendo un obstáculo de fabricación para su paso del laboratorio a las vacunas y los fármacos proteicos. Un estudio publicado en «Nature Communications» presenta el sistema de «intrón-exón separado» (SIE), que busca que el catalizador de ARN responsable de la circularización trabaje repetidamente como una enzima industrial.

El método PIE tradicional dispone la ribozima de intrón del grupo I y la secuencia que se desea circularizar en un mismo ARN precursor; cada vez que se completa el empalme de una molécula, la ribozima también pasa a formar parte de los productos de la reacción, lo que dificulta su reutilización y deja impurezas que deben eliminarse, como precursores lineales e intrones libres. En cambio, SIE separa ambos elementos en moléculas de ARN independientes: una conserva el núcleo catalítico y la otra porta la secuencia que se desea circularizar. Ambas se aparean mediante secuencias de reconocimiento y, a continuación, completan dos reacciones de transesterificación. La ribozima permanece intacta después de la reacción, por lo que podría entrar en una nueva ronda de catálisis.

El equipo de investigación confirmó los productos mediante electroforesis, RT-qPCR, tratamiento con RNase R y secuenciación de la unión de empalme, y produjo ARN circular de hasta aproximadamente 5,7 kb. En las condiciones del ensayo, la reacción se aproximó a la fase de meseta en unos 3 a 5 minutos; el sistema también pudo procesar sustratos con modificaciones químicas como N⁶-metiladenosina o N¹-metilpseudouridina. Como las modificaciones solo están presentes en el sustrato y no interfieren con la ribozima preparada por separado, SIE mantuvo una capacidad de circularización evidente incluso cuando los nucleótidos correspondientes de la materia prima se sustituyeron por completo por nucleótidos modificados, mientras que los sistemas comparativos PIE y TRIC del estudio perdieron gran parte de su actividad.

El diseño directamente relacionado con la producción en masa consiste en inmovilizar en microesferas magnéticas de estreptavidina la ribozima con biotina en el extremo 3. Tras la separación magnética, la contaminación por ribozimas en la solución de reacción fue prácticamente indetectable; la ribozima inmovilizada siguió siendo capaz de sintetizar ARN circular después de 20 rondas consecutivas de uso, aunque el rendimiento ya había mostrado un descenso moderado. Esto indica que la recuperación no está exenta de pérdidas: los intrones libres podrían seguir adhiriéndose a la ribozima y la regeneración repetida también podría perjudicar su estabilidad, por lo que en el futuro quizá sea necesario adoptar un método de inmovilización covalente más sólido.

El equipo produjo además ARN circular que codifica un fragmento de anticuerpo anti-PD-L1 y eritropoyetina humana. En células humanas, la expresión proteica de ambos productos se mantuvo durante más tiempo que la del mRNA lineal correspondiente; después de encapsularlo en nanopartículas lipídicas, el ARN circular que codifica la eritropoyetina también aumentó la proporción de reticulocitos en ratones. No se observaron diferencias significativas en los indicadores examinados de función hepática y renal ni en TNF-α, pero se trata únicamente de una prueba de concepto en animales de alcance limitado y no puede considerarse una evaluación toxicológica o de seguridad inmunitaria completa.

La solicitud internacional de patente publicada define SIE como un sistema de dos componentes formado por una ribozima y un sustrato, y enumera sustratos de distintas longitudes, condiciones de reacción y usos como vacunas y expresión de proteínas; una patente china relacionada intenta circularizar la propia ribozima catalítica lineal para mejorar su estabilidad y eficiencia de reutilización. Los autores del artículo también revelaron que cinco de ellos son inventores de SIE y sus aplicaciones, y que la tecnología ya ha obtenido una patente china y ha sido objeto de una solicitud PCT, lo que indica que este estudio cuenta al mismo tiempo con una estrategia clara de traslación y propiedad intelectual.

Sin embargo, el estudio todavía no ha mostrado lotes ampliados que cumplan las normas de fabricación de medicamentos y tampoco incluye una comparación completa con los procesos actuales en cuanto a costes, tasa de recuperación, perfil de impurezas y consistencia entre lotes. La respuesta inmunitaria al ARN circular suele verse afectada por el ARN lineal residual, los extremos trifosfato y las huellas de empalme; aunque SIE puede reducir la incorporación de ribozimas, no sustituye la purificación posterior ni los controles de calidad. Por ahora se asemeja más a un prototipo modular de fabricación respaldado por datos experimentales; aún queda un recorrido de validación técnica y regulatoria antes de demostrar que puede suministrar de forma estable productos de grado terapéutico a escala industrial.