تحويل الريبوزيم إلى أداة قابلة لإعادة الاستخدام: نظام جديد يفكك خطوة محورية في الإنتاج واسع النطاق للحمض النووي الريبي الدائري

لا يمتلك الحمض النووي الريبي الدائري طرفين يسهل تعرضهما لهجوم إنزيمات النوكلياز، ولذلك فهو أكثر مقاومة للتحلل من RNA الخطي، وقد يتيح أيضًا تعبيرًا بروتينيًا أطول أمدًا. ومع ذلك، لا تزال القدرة على إنتاج هذه الجزيئات بنقاء واستقرار كافيين وبتكلفة يمكن التحكم فيها تمثل عقبة تصنيعية أمام انتقالها من المختبر إلى اللقاحات والأدوية البروتينية. وتقترح دراسة منشورة في «Nature Communications» نظام «الإنترون–الإكسون المنفصل» (SIE)، في محاولة لجعل محفّز RNA المسؤول عن تكوين الحلقة يعمل بصورة متكررة مثل الإنزيمات الصناعية.

في طريقة PIE التقليدية، يُرتّب ريبوزيم الإنترون من المجموعة الأولى والتسلسل المراد تدويره على جزيء RNA سلف واحد؛ ومع اكتمال تضفير كل جزيء، يصبح الريبوزيم بدوره أحد نواتج التفاعل، ما يصعّب إعادة استخدامه ويخلّف شوائب تحتاج إلى الإزالة، مثل السلائف الخطية والإنترونات الحرة. أما SIE فيفصل الاثنين إلى جزيئي RNA مستقلين: يحتفظ أحدهما بالنواة المحفِّزة، بينما يحمل الآخر التسلسل المراد تدويره. ويقترن الجزيئان عبر تسلسلات تعرّف، ثم يُتمّان تفاعلي أسترة تبادلية. ويظل الريبوزيم سليمًا بعد التفاعل، ما يتيح له احتمال الدخول في دورة تحفيز تالية.

أكد فريق البحث النواتج باستخدام الرحلان الكهربائي وRT-qPCR والمعالجة بإنزيم RNase R وتسلسل موضع اتصال التضفير، كما أنتج RNA دائريًا بطول بلغ نحو 5.7 kb كحد أقصى. وفي ظروف الاختبار، اقترب التفاعل من مرحلة الثبات خلال نحو 3 إلى 5 دقائق؛ كما استطاع النظام معالجة ركائز أضيفت إليها تعديلات كيميائية، مثل N⁶-ميثيل أدينوسين أو N¹-ميثيل سودويوريدين. ولأن التعديلات تقتصر على الركيزة ولا تتداخل مع الريبوزيم المُحضّر بصورة مستقلة، احتفظ SIE بقدرة واضحة على تكوين الحلقات حتى عند الاستبدال الكامل للمواد الأولية المعنية بنيوكليوتيدات معدّلة، في حين فقد نظاما المقارنة PIE وTRIC في الدراسة قدرًا كبيرًا من نشاطهما.

التصميم المرتبط فعليًا بالإنتاج واسع النطاق تمثل في تثبيت الريبوزيم، الذي يحمل البيوتين عند الطرف 3′، على خرز مغناطيسي مطلي بالستربتافيدين. وبعد الفصل المغناطيسي، كان تلوث محلول التفاعل بالريبوزيم شبه غير مرئي؛ وظل الريبوزيم المثبّت قادرًا على تصنيع RNA دائري بعد 20 دورة متتالية من الاستخدام، لكن الإنتاجية كانت قد شهدت انخفاضًا متوسطًا. ويشير ذلك إلى أن الاسترداد لا يخلو من الفاقد: فقد تستمر الإنترونات الحرة في الالتصاق بالريبوزيم، كما قد تؤدي دورات التجديد المتكررة إلى الإضرار باستقراره، وقد يلزم مستقبلًا استخدام طريقة تثبيت تساهمي أكثر إحكامًا.

صنع الفريق أيضًا RNA دائريًا يشفّر جزءًا من جسم مضاد لـPD-L1، وآخر يشفّر الإريثروبويتين البشري. وفي الخلايا البشرية، استمر التعبير البروتيني لكلا الناتجين مدة أطول من جزيئات mRNA الخطية المناظرة؛ وبعد تغليفه في جسيمات نانوية دهنية، رفع RNA الدائري المشفّر للإريثروبويتين أيضًا نسبة الخلايا الشبكية في الفئران. ولم تُظهر مؤشرات وظائف الكبد والكلى وTNF-α التي فحصتها الدراسة فروقًا ذات دلالة، لكن ذلك لا يعدو كونه إثباتًا للمفهوم في مجموعة محدودة النطاق من التجارب الحيوانية، ولا يمكن اعتباره تقييمًا كاملًا للسمية أو السلامة المناعية.

يعرّف طلب براءة الاختراع الدولي المنشور SIE بأنه نظام ثنائي المكوّنات يتألف من ريبوزيم وركيزة، ويورد ركائز بأطوال مختلفة وظروف تفاعل واستخدامات تشمل اللقاحات والتعبير البروتيني؛ بينما تحاول براءة اختراع صينية ذات صلة تدوير الريبوزيم المحفِّز الخطي نفسه لتحسين الاستقرار وكفاءة إعادة الاستخدام. وكشف مؤلفو الورقة أيضًا أن خمسة منهم مخترعون لنظام SIE وتطبيقاته، وأن التقنية حصلت على براءة اختراع صينية وقُدّم بشأنها طلب بموجب معاهدة التعاون بشأن البراءات (PCT)، ما يبيّن أن الدراسة تتضمن في الوقت نفسه توجهًا واضحًا نحو التطبيق العملي وحماية الملكية الفكرية.

مع ذلك، لم تعرض الدراسة بعد دفعات موسّعة متوافقة مع معايير تصنيع الأدوية، كما تفتقر إلى مقارنة كاملة مع عمليات التصنيع الحالية من حيث التكلفة ومعدل الاسترداد وطيف الشوائب والاتساق بين الدفعات. وغالبًا ما تتأثر الاستجابة المناعية للـRNA الدائري ببقايا RNA الخطي والنهايات ثلاثية الفوسفات وآثار التضفير؛ وعلى الرغم من أن SIE يستطيع تقليل اختلاط الريبوزيم، فإنه لا يمكن أن يحل محل عمليات التنقية اللاحقة واختبارات الجودة. وفي الوقت الراهن، يبدو أقرب إلى نموذج أولي معياري للتصنيع تدعمه أدلة تجريبية، ولا يزال إثبات قدرته على توفير منتجات علاجية الدرجة بصورة مستقرة وعلى نطاق صناعي يتطلب اجتياز مرحلة من التحقق الهندسي والتنظيمي.