Imágenes con menos de un fotón: EFLIM acelera la visualización de señales temporales dentro de las células

La microscopía de fluorescencia no solo puede registrar dónde se emite luz, sino también medir cuánto tarda en desvanecerse, lo que permite obtener información sobre el entorno químico y las interacciones moleculares de las células. Sin embargo, para estimar con precisión este «tiempo de vida de la fluorescencia», medido en apenas nanosegundos, normalmente es necesario acumular una gran cantidad de fotones; cuando el tejido vivo se mueve, la señal puede distorsionarse fácilmente, y la exposición prolongada también puede causar fotoblanqueo y fototoxicidad.

Un equipo de investigación integrado por la Universidad Nacional Tsing Hua y otras instituciones publicó en 《Nature Biotechnology》 el método de imagen de tiempo de vida de fluorescencia basado en eventos del primer fotón, EFLIM. El análisis tradicional acumula los tiempos de llegada de una gran cantidad de fotones en un histograma, mientras que EFLIM trata cada excitación láser como un evento: el detector o bien no recibe ningún fotón o registra el momento de llegada del primer fotón. Esta forma de representación conserva la estructura temporal de señales extremadamente dispersas, tras lo cual un modelo de eliminación de ruido autosupervisado estima el tiempo de vida de la fluorescencia sin necesidad de usar imágenes con gran cantidad de luz como respuestas de referencia para el entrenamiento.

El artículo muestra que EFLIM reduce en más de dos órdenes de magnitud el número de fotones necesarios frente a los algoritmos existentes y que, incluso con un promedio inferior a un fotón por píxel, puede generar imágenes estables del tiempo de vida. El equipo también observó señales neuronales de calcio en el cerebro de ratones despiertos a una profundidad aproximada de 250 micrómetros; según la información publicada por la universidad, durante la adquisición se registraron aproximadamente entre 0,2 y 0,8 fotones por píxel, y el método pudo reducir las señales falsas provocadas por el movimiento de los animales y las fluctuaciones de la intensidad de fluorescencia.

La baja cantidad de luz no solo permite una iluminación más suave, sino que también facilita la captura de procesos biológicos rápidos. Los investigadores siguieron cambios transitorios del calcio intracelular en células HeLa vivas y, en un único canal espectral, distinguieron células B del centro germinal y células T colaboradoras foliculares mediante sus diferentes tiempos de vida de fluorescencia. La adquisición tridimensional durante dos horas mostró el movimiento y el contacto directo de ambos tipos de linfocitos, además de una señalización intercelular que el equipo consideró posiblemente mediada por vesículas; «posiblemente» sigue siendo la palabra clave, pues las imágenes observadas todavía no bastan por sí solas para demostrar el origen y la función de las vesículas.

La aplicación patológica se demostró con tejido humano de glioma. Según la información de la universidad, los investigadores capturaron 169 campos de visión, con un tiempo de 0,33 segundos por campo, aproximadamente una décima parte del tiempo requerido por los métodos tradicionales; sin añadir marcadores exógenos, las imágenes distinguieron diferencias en el tiempo de vida entre células tumorales, vasos sanguíneos, estroma y zonas necróticas, y se compararon con cortes histológicos. Este resultado indica que la fluorescencia endógena podría ayudar a delinear rápidamente la heterogeneidad tumoral, pero aún no equivale a una validación clínica de la precisión diagnóstica ni de los beneficios quirúrgicos.

El equipo ha publicado la implementación de EFLIM en Python, una simulación de la llegada de fotones en MATLAB, datos brutos representativos y flujos de trabajo para procesar datos SPC de Becker & Hickl y PTU de PicoQuant. La publicación del código ayuda a otros laboratorios a comprobar la reproducibilidad y también reduce las barreras para adoptar el método; sin embargo, aún se requieren pruebas independientes para determinar si puede mantener un rendimiento equivalente con diferentes microscopios, detectores, tipos de tejido y colorantes.

Actualmente, EFLIM es ante todo un método de imagen computacional, no una herramienta patológica con autorización clínica. Los modelos autosupervisados pueden transformar el ruido en estructuras aparentemente lisas, por lo que en el futuro, además de comparar la calidad de las imágenes, será necesario cuantificar los sesgos, los escenarios de fallo y la estabilidad entre equipos. Solo si se aclaran estas cuestiones, la velocidad y el margen de seguridad obtenidos al reducir la necesidad de fotones podrían ampliar realmente su ámbito de uso en neurociencia in vivo, inmunología e interpretación rápida de tejidos.