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Lectura repetida de un mismo péptido mediante nanoporos, un avance gradual hacia la secuenciación de proteínas a nivel de molécula individual
Un equipo de investigación fijó péptidos en un nanoporo para medirlos repetidamente mientras eliminaba los aminoácidos uno por uno. El método ya permite distinguir sustituciones puntuales, modificaciones postraduccionales y residuos no naturales, pero aún queda un considerable camino de ingeniería antes de poder analizar directamente muestras biológicas complejas.
La secuenciación de ADN transformó las ciencias de la vida, pero trasladar una capacidad similar a las proteínas es mucho más difícil. Las proteínas no solo contienen 20 aminoácidos comunes, sino que también experimentan modificaciones postraduccionales, como la fosforilación. Si estas diferencias pudieran leerse directamente a escala de molécula individual, los investigadores podrían detectar variantes proteicas poco frecuentes que quedan ocultas en los análisis convencionales basados en promedios globales. Un equipo de la Universidad de Nankín ha publicado ahora en «Nature» un método basado en nanoporos que supone un avance hacia este objetivo.
La tecnología se denomina «bucle transitorio del analito en el poro» (transient pore analyte looping, tPAL). Los investigadores modificaron un nanoporo MspA procedente de Mycobacterium smegmatis, incorporaron en su interior una estructura adaptadora que se une a iones de níquel y fijaron el péptido que se iba a analizar. El extremo N-terminal del péptido entra repetidamente en la zona de detección, lo que genera múltiples señales comparables de corriente iónica, en lugar de que la molécula atraviese rápidamente el poro y produzca una sola lectura.
La información de la secuencia surge de la coordinación entre la lectura y el corte. El equipo añadió una aminopeptidasa modificada con colesterol para que la enzima eliminara un aminoácido cada vez desde el extremo N-terminal. Tras la eliminación de cada aminoácido, el nuevo extremo N-terminal entra en la posición de detección del nanoporo y genera el cambio de corriente correspondiente a la siguiente etapa. Al acortar gradualmente el mismo péptido fijado, las señales sucesivas pueden convertirse en indicios para inferir la secuencia.
El estudio mostró que tPAL puede diferenciar péptidos a escala de un solo aminoácido, incluidas sustituciones puntuales, modificaciones postraduccionales e inserciones de aminoácidos no naturales. Para un conjunto de 20 péptidos que solo diferían en el residuo N-terminal, el equipo recopiló señales a tres voltajes, extrajo múltiples características y aplicó aprendizaje automático para clasificarlas. Una máquina de vectores de soporte cuadrática alcanzó una precisión máxima del 98 % en una validación cruzada de diez particiones. Este resultado demuestra que las señales poseen una gran capacidad discriminatoria, pero sigue siendo una validación en un conjunto de datos controlado y no puede equipararse directamente con la precisión de secuenciación en muestras clínicas desconocidas.
El valor de este diseño reside en que utiliza la «relectura» para reducir el problema de las fluctuaciones habituales en las señales de moléculas individuales, al tiempo que conserva información química como las modificaciones y los residuos no naturales. Si pudiera ampliarse a mezclas de proteínas más largas y complejas, en el futuro podría subsanar algunas limitaciones de la espectrometría de masas en el análisis de moléculas de baja abundancia, isoformas proteicas y diferencias entre células. También podría utilizarse para la identificación detallada de biomarcadores de enfermedades o péptidos terapéuticos.
Por ahora, tPAL no debe considerarse una plataforma completa de secuenciación de proteínas capaz de sustituir directamente a la espectrometría de masas. El método exige fijar primero el péptido y cortarlo secuencialmente desde el extremo N-terminal, y la propia lectura consume la molécula analizada. La información publicada en el artículo aún no demuestra que pueda reconstruir proteomas a gran escala en muestras biológicas complejas no definidas previamente, con suficiente rendimiento, cobertura y control de errores. La capacidad de generalización de los modelos de aprendizaje automático entre distintos nanoporos, lotes y condiciones de las muestras también debe validarse con datos independientes.
Para pasar de una prueba de concepto a una herramienta práctica, los próximos pasos serán aumentar el grado de paralelización, crear una biblioteca más completa de señales de aminoácidos y modificaciones, y abordar tanto la eficiencia del corte enzimático como la pérdida de señales en la lectura de secuencias largas. El equipo de investigación ha solicitado patentes sobre el método tPAL y sus aplicaciones. La prueba científica más importante será determinar si puede dejar atrás los péptidos cuidadosamente diseñados y leer de forma fiable moléculas desconocidas presentes en células reales y muestras clínicas.