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Hacer que cada proteína se ilumine por separado en células vivas: NovoTags diseñadas por IA amplían la microscopía multicolor
Tres proteínas miniaturizadas diseñadas desde cero pueden unirse con precisión a distintos colorantes fluorescentes y permiten obtener imágenes de superresolución y de tiempo de vida de la fluorescencia en células humanas vivas; estas herramientas también llevan la observación de las interacciones entre proteínas a una nueva etapa, en la que pueden activarse y controlarse mediante colorantes.
Identificar proteínas específicas dentro de una célula no solo exige iluminarlas, sino también evitar que múltiples marcadores mezclen sus colores o interfieran con sus funciones originales, además de resistir sesiones prolongadas de obtención de imágenes. Equipos de la Universidad de Washington, el Campus de Investigación Janelia del HHMI y el Laboratorio Europeo de Biología Molecular han diseñado ahora desde cero, mediante inteligencia artificial, un conjunto de pequeñas etiquetas fluorescentes llamadas NovoTags, con el objetivo de combinar la localización precisa del marcaje genético con el alto brillo y la fotoestabilidad de los colorantes de moléculas pequeñas.
Los investigadores diseñaron proteínas de unión específicas para los colorantes permeables a las células JF657, JF596 y JF494, que abarcan los espectros rojo lejano, rojo anaranjado y verde. Estas tres NovoTags pueden seleccionar sus respectivos colorantes con afinidades en el rango nanomolar bajo. Posteriormente, el equipo de investigación unió las etiquetas a las proteínas objetivo, lo que permitió visualizar distintas estructuras celulares tras añadir los colorantes, sin depender de la emisión de luz de las propias proteínas fluorescentes naturales.
El diseño no se completó únicamente en computadoras. El equipo utilizó RFdiffusion para crear los esqueletos proteicos, LigandMPNN para organizar las secuencias de aminoácidos y AlphaFold y RoseTTAFold para seleccionar los candidatos. Después, los validó progresivamente mediante presentación en superficie de levaduras, clasificación celular por citometría de flujo, secuenciación y análisis bioquímicos. La estructura cristalina de NovoTag657 unida al colorante también se determinó con una resolución de 2,38 angstroms. Esta estructura monomérica de 135 aminoácidos se aproximó al modelo computacional, lo que aporta respaldo experimental a que el diseño se materializó realmente a escala atómica.
En células de mamíferos, las tres etiquetas pueden marcar simultáneamente distintos compartimentos subcelulares. Los investigadores también demostraron la microscopía STED de superresolución en células vivas y la obtención de imágenes de tiempo de vida de la fluorescencia en líneas celulares humanas. Además de diferenciar las señales por su color, pudieron aprovechar las diferencias en el tiempo de emisión producidas por la influencia del entorno proteico circundante sobre los colorantes, aumentando las combinaciones de marcadores distinguibles en un mismo campo visual. El equipo propuso que, en el futuro, las combinaciones de espectro y tiempo de vida podrían permitir el seguimiento de más proteínas, pero identificar hasta 30 marcadores a la vez sigue siendo un objetivo de desarrollo y no una demostración conseguida en este estudio.
Otra extensión de este sistema es NovoSplit. Los investigadores dividieron la etiqueta en dos partes y unieron cada una a una proteína diferente. Tras añadir el colorante especificado, este actúa como un pegamento molecular que induce el ensamblaje de ambas mitades y genera simultáneamente una señal fluorescente. Por tanto, puede indicar si dos proteínas están próximas y también activar químicamente su interacción. El equipo creó además una versión capaz de formar un enlace covalente con el colorante para aumentar la persistencia del marcaje.
Sin embargo, por ahora NovoTags sigue siendo una herramienta de investigación, no una tecnología de imagen clínica. Los resultados publicados proceden principalmente de células humanas u otras células de mamíferos cultivadas, y aún no se ha demostrado su rendimiento en tejidos, animales completos o seguimientos prolongados. Unir proteínas artificiales a los objetos de estudio y añadir después los colorantes también podría alterar la localización de las proteínas, sus interacciones o el estado celular, algo que debe descartarse individualmente en cada experimento. La permeabilidad celular, la señal de fondo y la toxicidad de los distintos colorantes también limitarán las condiciones en las que pueden utilizarse.
El estudio, publicado en «Science», muestra que el papel del diseño generativo de proteínas está pasando de predecir estructuras a fabricar herramientas celulares operables. Si posteriormente se logran desarrollar más etiquetas mutuamente ortogonales, de menor tamaño y menor toxicidad, estas podrían conectarse con la microscopía correlativa criogénica óptica y electrónica, permitiendo que los investigadores localicen primero sus objetivos en células vivas y después examinen sus estructuras in situ. Por ahora, su valor más práctico consiste en añadir una opción programable para los experimentos de obtención de imágenes multicolor e interacción entre proteínas.